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關(guān)鍵詞 高效液相色譜質(zhì)譜，固相多肽合成，消旋，多肽測(cè)序
1 引言
1963年Merrifield創(chuàng)建了固相多肽合成，用簡(jiǎn)單的洗滌操作代替了經(jīng)典合成方式中的分離、重結(jié)晶、板層和柱層等純化操作，其優(yōu)越性使該方法廣泛用于各種模式多肽和天然多肽的制備。但產(chǎn)物消旋是合成中普遍存在的現(xiàn)象，即原料氨基酸為L(zhǎng)型（或D型），而產(chǎn)物中某些氨基酸殘基會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)镈型（或L型）[1]，從而影響終產(chǎn)品純度與收率。因此，防止消旋化成為多肽合成中一個(gè)十分重要的問(wèn)題，而消旋產(chǎn)物的檢測(cè)與分析是其中的關(guān)鍵。
RPHPLC具有極高的分辨率，已廣泛應(yīng)用于多肽和蛋白的分離。由于多肽在疏水性固定相表面上的吸附與解吸不僅取決于氨基酸序列，而且與其空間結(jié)構(gòu)有關(guān)，即“疏水腳”的細(xì)微差別將使構(gòu)象不同的多肽具有不同的色譜保留行為[2]。因此，RPHPLC可有效分離序列幾乎完全相同的多肽及多肽的消旋化產(chǎn)物[ 3～5]。
本研究對(duì)采用HBTU/Fmoc固相法[6]化學(xué)合成弱疏水性七肽（H2NPFNSLAICOOH）時(shí)出現(xiàn)的消旋產(chǎn)物進(jìn)行了RPHPLC/MS分析：基于適用于不同分離對(duì)象的塔板理論[7]、Onoff理論[8]和計(jì)量置換理論[9]等已有RPHPLC保留機(jī)理，根據(jù)弱疏水性多肽特性 ，提出“早期吸附”概念，并經(jīng)色譜條件優(yōu)化，得到了峰形良好的譜峰。通過(guò)將不同MSn條件下所得離子碎片和豐度信息進(jìn)行選擇性疊加[10]，實(shí)現(xiàn)了對(duì)每一多肽的一級(jí)測(cè)序，由此成功分析了合成七肽的4個(gè)消旋產(chǎn)物，為消旋化檢測(cè)提供了一種新方法。
2 實(shí)驗(yàn)部分
2.1 儀器和試劑
高效液相色譜系統(tǒng)(大連依利特分析儀器有限公司),包括P200Ⅱ型高壓恒流泵、UV200Ⅱ紫外可變波長(zhǎng)檢測(cè)器和Echrom98色譜工作站。色譜柱：Lichrosorb RP18, 粒徑5 μm, 填料孔徑10 nm, 200 mm×4.6 mm（美國(guó)惠普公司）；Lichrospher 100 C18, 粒徑5 μm, 填料孔徑10 nm, 250 mm×4 mm（德國(guó)Merck公司）;液/質(zhì)聯(lián)用儀：電噴霧離子阱質(zhì)譜LCQ Advantage MAX，Bioworks 3.0數(shù)據(jù)處理軟件（美國(guó)Thermo Finnigan公司）。七肽按文獻(xiàn)[11]采用固相法手工合成；乙腈（色譜純，德國(guó)Merck公司）；三氟乙酸（TFA）（色譜純，迪馬公司）；超純水（自制）。
2.2 色譜條件
流動(dòng)相：A液：水（0.1％TFA）；B液：乙腈（0.1％TFA）。最優(yōu)梯度洗脫模式：0→10 min，B液0→7%；10→14 min，B液7％→30%；14→48 min，B液30％→50%。柱溫：室溫；流速：0.7 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm；樣品用60%乙腈/水溶解，濃度5 g/L；進(jìn)樣量20 μL。
2.3 質(zhì)譜分析
色譜條件同上。電噴霧電離（ESI），正離子檢測(cè)，碰撞氣為氦氣，霧化氣（N2）流速5 μＬ/min，源溫200℃，霧化壓力0.345 MPa；掃描范圍：50～2000 m/z。第一次質(zhì)譜分析采用全掃描，以獲得每個(gè)色譜峰準(zhǔn)確且單一的m/z值，隨后的質(zhì)譜分析中改變相對(duì)碰撞能量等參數(shù)以獲得一系列MS2圖譜來(lái)完成多肽測(cè)序，采用Bioworks 3.0軟件分析碎片信息，按文獻(xiàn)[10]方法進(jìn)行譜圖的疊合解析。
3 結(jié)果與討論
3.1 合成七肽粗品的質(zhì)譜直接進(jìn)樣分析
對(duì)合成七肽粗品用質(zhì)譜注射泵直接進(jìn)樣進(jìn)行全掃描分析，得到單一的m/z 761.5 [M＋H]+ 峰，與目標(biāo)多肽分子量760.9吻合，說(shuō)明合成產(chǎn)物純度很高，并未生成大量斷頭肽和空心肽之類的雜質(zhì)。
3.2 合成七肽粗品的RPHPLC分析
3.2.1 弱疏水性多肽RPHPLC保留行為解析 RPHPLC中溶質(zhì)保留機(jī)理的預(yù)測(cè)一直是色譜理論研究的熱點(diǎn)，迄今為止提出的模型多達(dá)10余種，應(yīng)用較多的主要有：適用于小分子物質(zhì)的塔板理論[7]、Snyder經(jīng)驗(yàn)公式、溶解度參數(shù)模型、溶劑色效模型、疏溶劑化模型等[8]；而對(duì)于生物大分子而言，Onoff模型[9]、尤其是耿信篤提出的計(jì)量置換保留理論（SDTR）是目前公認(rèn)的保留機(jī)理[8]。
基于吸附機(jī)制提出的Onoff模型認(rèn)為：在多肽及蛋白質(zhì)的RPHPLC分析中，初始洗脫條件下有機(jī)改性劑濃度較低，溶質(zhì)分子與固定相之間的疏水作用較強(qiáng)，幾乎完全吸附，“停滯”不動(dòng)。而一旦洗脫液中有機(jī)改性劑（或稱為強(qiáng)溶劑、置換劑等）達(dá)到臨界濃度，使得多肽或蛋白質(zhì)與流動(dòng)相間的作用大于其與固定相的作用，則溶質(zhì)“瞬時(shí)”解吸到流動(dòng)相，并形成尖銳的洗脫峰，此后溶質(zhì)與固定相無(wú)任何作用。這一理論對(duì)于疏水性很強(qiáng)的蛋白質(zhì)和多肽等大分子物質(zhì)是適用的。
對(duì)于實(shí)驗(yàn)中合成的弱疏水性七肽（親疏水性值按文獻(xiàn)[12]方法計(jì)算為－6.1），本研究提出可將色譜柱前后分為吸附段a和分配段b兩段，并認(rèn)為溶質(zhì)的色譜保留行為是吸附和分配兩種機(jī)理的綜合。初始洗脫條件下有機(jī)改性劑濃度較低，溶質(zhì)被完全吸附于a段，為吸附機(jī)制控制；當(dāng)洗脫液中有機(jī)改性劑達(dá)到臨界濃度，多肽被瞬時(shí)洗脫后，并非像“Onoff”理論所述溶質(zhì)與固定相之間再無(wú)任何關(guān)系，而是在b段仍有一定作用，為分配機(jī)制所控制。為了增大分配機(jī)制在b段的貢獻(xiàn)，可引入“早期吸附”過(guò)程，即將初始洗脫液中有機(jī)改性劑濃度設(shè)為極低值，并保持一段時(shí)間（約10 min）。此時(shí)，由于流動(dòng)相溶劑與被分離多肽之間的作用力遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于固定相與多肽之間的作用力，則樣品在初期即可快速而完全地吸附于固定相上。因此前段的吸附段a明顯縮短；又由于每根色譜柱柱長(zhǎng)一定，a段縮短相對(duì)延長(zhǎng)了后段分配段b的長(zhǎng)度，因此，可實(shí)現(xiàn)增大b段中分配機(jī)制貢獻(xiàn)的目的。如圖１所示，當(dāng)引入“早期吸附”后，分離度得到改善；反之，當(dāng)舍棄“早期吸附”時(shí)，則溶質(zhì)未能充分吸附即被快速洗脫，所以出峰較早、分離度較差（圖２）。
圖１ 引入“早期吸附”合成七肽的色譜圖（略）
Fig.１ Chromatogram of heptapeptide with preadsorption
B%為流動(dòng)相中B液的體積分?jǐn)?shù)（B% is the volume fraction of solution B in mobile phase)。
在相同洗脫條件下，使用３支不同塔板數(shù)的C18色譜柱分析該七肽。如果按Onoff理論所述單純由吸附控制，則分離度與塔板數(shù)無(wú)關(guān)，應(yīng)得到相同的譜圖。但實(shí)驗(yàn)結(jié)果卻發(fā)現(xiàn)，分離度有一定差異（圖３），說(shuō)明b段的分配機(jī)制對(duì)分離效果確有影響。綜合考慮a、b兩段，可以證明：弱疏水性小肽的RPHPLC保留行為不同于疏水性蛋白，是分配和吸附雙重機(jī)制共同作用的結(jié)果。
圖2 舍棄“早期吸附”的合成七肽色譜圖（略）
Fig.2 Chromatogram of heptapeptide without preadsorption
B%為流動(dòng)相中B液的體積分?jǐn)?shù)(B% is the volume fraction of solution B in mobile phase)。
圖３ ３支不同塔板數(shù)的C18色譜柱分析（略）
Fig.３ Analysis using three C18 chromatographic columns with different plate numbers
1. Lichrosorb RP18（10 μm, 10 nm, 200 mm×4.6 mm） 塔板數(shù)(plate numbers)=6000; 2. Lichrosorb RP18（5 μm, 10 nm, 200 mm×4.6 mm） 塔板數(shù)(plate numbers)=12000; 3. Lichrospher100 C18（5 μm, 10 nm, 250 mm×4 mm） 塔板數(shù) (plate numbers)=15000。
3.2.2 RPHPLC分析條件優(yōu)化 首先用純乙腈和純水組成的梯度洗脫體系分析合成七肽粗品（圖４A），峰1（圖中標(biāo)識(shí)）未得到理想分離；隨后不斷降低梯度斜率，以使峰1與其它譜峰分開，得到一系列色譜圖（圖４B、４C、４D）。由圖可知：隨著梯度斜率的緩慢降低，分離度得到改善，但峰形逐漸變鈍，并發(fā)生托尾。這說(shuō)明疏水性蛋白和多肽對(duì)有機(jī)改性劑的變化較為敏感[13]；相反弱疏水性小肽（即本文所合成七肽的消旋產(chǎn)物，對(duì)應(yīng)于圖４中各譜峰）則反應(yīng)“遲鈍”。即將后者從固定相上洗脫所需溶劑突越范圍較寬[14]，改變梯度斜率對(duì)其影響相對(duì)較小。所以，當(dāng)梯度斜率降至一定程度時(shí)，只有改變其它色譜條件方能得到理想峰形。
圖4 不同梯度條件下的合成七肽（弱疏水性肽）色譜圖（略）
Fig.4 Chromatograms of heptapeptides (i.e. weak hydrophobic peptides) at different gradient elution conditions
B%為流動(dòng)相中B液的體積分?jǐn)?shù)(lichrospher100 C18, 5 μm, 10 nm, 250 mm×4 mm; B% is the volume fraction of solution B in mobile phase)。
在流動(dòng)相中加入0.1%的TFA，如圖５所示（洗脫模式見2.2），分離效果理想，共得到4個(gè)譜峰。根據(jù)3.1質(zhì)譜直接進(jìn)樣分析結(jié)果，初步證明4個(gè)譜峰對(duì)應(yīng)于七肽的4個(gè)消旋產(chǎn)物。
3.3 液質(zhì)聯(lián)用對(duì)合成七肽消旋產(chǎn)物的測(cè)序分析
首先采用LC/ESI/MS對(duì)圖５中的4個(gè)譜峰進(jìn)行全掃描，發(fā)現(xiàn)4個(gè)譜峰的m/z均為761.5；隨后進(jìn)行第二次實(shí)驗(yàn)，使用LC/ESI/MS2對(duì)每一譜峰進(jìn)行在線多肽測(cè)序，通過(guò)改變相對(duì)碰撞能量６０、３８和２５ eV，得到豐富的碎片信息。結(jié)果表明：4種產(chǎn)物的分子量和序列完全一樣，是合成七肽的4個(gè)消旋產(chǎn)物，由排列組合分析可以推斷是肽鏈上的兩個(gè)氨基酸殘基發(fā)生了消旋[15]。
在進(jìn)行MS2測(cè)序時(shí)，很難在同一質(zhì)譜條件下得到全部碎片信息。不同條件下得到的圖譜在碎片離子峰的多少和信號(hào)強(qiáng)弱的分布區(qū)域等方面具有一定的互補(bǔ)性，可以有選擇地將譜圖疊合起來(lái)進(jìn)行分析，從而達(dá)到簡(jiǎn)化串聯(lián)質(zhì)譜解析和提高多肽測(cè)序準(zhǔn)確性的目的[10]。圖６為二級(jí)質(zhì)譜分析中合成七肽的b軸和y軸片段信息，由此確定了合成七肽的4個(gè)消旋產(chǎn)物。
圖５ 合成七肽最優(yōu)色譜圖（略）
Fig.５ Optimized chromatogram of heptapeptide
圖６ 譜圖疊加后的合成七肽MS2分析（略）
Fig.６ MS2 analysis of heptapeptide by spectrum superposition
�。粒铣善唠腷軸與y軸斷裂碎片示意圖(b and y fragment ions of synthsized heptapepetide); B. 合成七肽MS2譜圖(MS2 spectrum of synthesized heptapepetide)。
3.4 小結(jié)
本研究對(duì)采用HBTU/Fmoc固相法化學(xué)合成弱疏水性七肽（H2NPFNSLAICOOH）時(shí)出現(xiàn)的消旋現(xiàn)象進(jìn)行了RPHPLC/MS分析：（1）討論了弱疏水性七肽在RPHPLC中保留機(jī)理的特殊性，基于塔板理論、onoff理論和計(jì)量置換理論提出了“早期吸附”概念，以此優(yōu)化色譜條件可充分利用分配和吸附雙重保留機(jī)制來(lái)改善分離效果，并最終得到4個(gè)峰形良好的色譜峰；（2）質(zhì)譜直接進(jìn)樣分析表明：4譜峰具有相同的m/z 761.5 [M＋H]+ 值，與目標(biāo)多肽分子量760.9吻合，對(duì)應(yīng)于合成七肽的4種消旋產(chǎn)物；（3）對(duì)每一譜峰進(jìn)行在線多肽測(cè)序，將不同MS2條件下的離子碎片和豐度信息進(jìn)行選擇性疊加，得到b軸和y軸的碎片信息，成功地分析了合成七肽的4個(gè)消旋產(chǎn)物。
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